堿基編輯技術(shù)最早由哈佛大學(xué)David R. Liu團(tuán)隊(duì)開發(fā)，主要分為兩類：胞嘧啶堿基編輯器(CBE)與腺嘌呤堿基編輯器(ABE)，分別由胞嘧啶脫氨酶或改造的腺嘌呤脫氨酶與Cas9酶活突變型蛋白(nickase Cas9)融合而來(lái)。目前，CBE與ABE雖已在多個(gè)物種中得到廣泛應(yīng)用。然而通過(guò)不少實(shí)驗(yàn)研究表明它們?nèi)源嬖趪?yán)重的隨機(jī)脫靶現(xiàn)象，未得到完全解決。

2022年10月14日，聚焦于基因和細(xì)胞治療的上海邦耀生物科技有限公司 (以下簡(jiǎn)稱"邦耀生物")宣布，與華東師范大學(xué)李大力教授及劉明耀教授團(tuán)隊(duì)合作開發(fā)并命名了一種精準(zhǔn)且安全的新型腺嘌呤堿基編輯器 -- " ABE9 "，能夠有效解決ABE 臨床應(yīng)用存在的各類脫靶隱患和安全性問(wèn)題， 理論上將為近50% 遺傳致病性 SNVs 的糾正提供了新的精準(zhǔn)靶向工具。 該項(xiàng)研究成果于10月13日正式在國(guó)際學(xué)術(shù)期刊Nature Chemical Biology 上發(fā)表。可以說(shuō)，這一發(fā)現(xiàn)對(duì)提升 ABE 工具的安全性，拓寬其適用范圍，推動(dòng)其在基因治療中的應(yīng)用及后續(xù)的臨床轉(zhuǎn)化均具有重要意義。

Nature Chemical Biology發(fā)文

值得一提的是，ABE9 作為新一代最具有臨床適用性的產(chǎn)品，已提前完成核心專利申請(qǐng)，未來(lái)專利布局將覆蓋全球主流市場(chǎng)。 目前，邦耀生物在ABE技術(shù)領(lǐng)域擁有持續(xù)而深厚的專利布局積累，在全球范圍內(nèi)已獲得授權(quán)的堿基編輯器專利達(dá)多個(gè)同族。

新型腺嘌呤堿基編輯器"ABE9 "：精準(zhǔn)且安全，臨床應(yīng)用潛力巨大

DNA堿基編輯器由于可以在不產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(DSB)、不需要供體DNA模板的情況下高效地催化堿基轉(zhuǎn)換，在種質(zhì)改良和基因治療中被寄予厚望。然而由David R. Liu團(tuán)隊(duì)開發(fā)的初代ABE7.10的編輯效率對(duì)于很多靶點(diǎn)而言卻不盡如人意，雖然David Liu等課題組通過(guò)分子進(jìn)化獲得了更高活性的ABE8(ABE8e 和ABE8s)，但是ABE一些固有的缺陷卻并沒有解決。例如，ABE引起的大量隨機(jī)的RNA脫靶編輯，由于編輯窗口較寬引起非目標(biāo)堿基改變而產(chǎn)生旁觀者效應(yīng)以及ABE會(huì)在特定的TCN motif的堿基序列中誘發(fā)胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)換。

該研究首先證明了高活性的ABE8e引發(fā)了更嚴(yán)重的旁觀者效應(yīng)以及Cas9非依賴的DNA和RNA脫靶，而且對(duì)于胞嘧啶的編輯效率顯著提高。為了解決ABE8e的精準(zhǔn)性問(wèn)題，該研究基于ABE8e的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)進(jìn)行理性設(shè)計(jì)和篩選，發(fā)現(xiàn)在TadA-8e脫氨酶的活性口袋引入關(guān)鍵突變L145T和N108Q(ABE9)可在保留高編輯活性的同時(shí)，顯著縮小編輯窗口到sgRNA的第5-6位的腺嘌呤，消除對(duì)胞嘧啶的編輯活性(圖1)。

圖1：TadA-8e蛋白結(jié)構(gòu)及ABE9編輯特性評(píng)價(jià)

通過(guò)鑒定Cas9非依賴性脫靶的R-Loop檢測(cè)以及RNA脫靶的轉(zhuǎn)錄組深度測(cè)序，發(fā)現(xiàn) ABE9 幾乎不引起隨機(jī)的DNA 和RNA 脫靶編輯（圖2 ），展示出了極高的應(yīng)用安全性。 此外，ABE9在小鼠和大鼠胚胎中展示了極高的體內(nèi)編輯精度和活性。在所有的F0代小鼠中，對(duì)照組ABE8e在編輯A5目標(biāo)位點(diǎn)的同時(shí)引起了大量的A8位的旁觀者編輯(18/19只)，精確編輯A5位的小鼠僅占5.1%。而ABE9可以精準(zhǔn)編輯A5(14/16只)，其中25%小鼠的編輯效率超過(guò)80%，所有F0小鼠的平均效率達(dá)到54.3%。同樣，ABE9在大鼠中能夠靶向Gaa基因精準(zhǔn)產(chǎn)生D645G突變而誘發(fā)龐貝氏病，F(xiàn)0代大鼠中僅含目的位點(diǎn)A6-to-G突變的達(dá)到48.41%，而ABE7.10的精準(zhǔn)編輯只占2.76%。嚙齒類動(dòng)物的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)再次證明了 ABE9 高精度特性，也凸顯了其在精準(zhǔn)構(gòu)建動(dòng)物模型的潛力（圖3 ）。

圖2：Cas9非依賴DNA 脫靶和RNA脫靶評(píng)價(jià)

圖3：ABE9動(dòng)物體內(nèi)編輯及糾正人類致病性的SNVs

另外，為進(jìn)一步評(píng)估ABE基因治療的潛能，研究者構(gòu)建含有人類致病性SNVs的細(xì)胞系，且需糾正的腺苷處于sgRNA第五位且處于多個(gè)連續(xù)腺苷中。結(jié)果表明，即使面對(duì)這樣極端富含旁觀者堿基的序列中，ABE9也能精準(zhǔn)編輯sgRNA第五位產(chǎn)生A-to-G的轉(zhuǎn)換，精確糾正能力相較于ABE8e最大提高了342.5倍(圖3)。

論文共同通訊作者，邦耀生物聯(lián)合創(chuàng)始人& 副總裁李大力教授表示： "在本次研究中，為了無(wú)差別的分析海量靶點(diǎn)中ABE9的精準(zhǔn)編輯特性，采用8000多條sgRNA與靶點(diǎn)配對(duì)的文庫(kù)進(jìn)行編輯窗口的分析，發(fā)現(xiàn)ABE9非常精準(zhǔn)且無(wú)序列偏好地主要編輯A5-A6兩位堿基，證明其廣泛地精準(zhǔn)編輯特性。總的來(lái)說(shuō)， ABE9 將編輯窗口縮窄至1-2nt ，幾乎完全消除了對(duì)胞嘧啶的脫靶編輯，更重要的是將DNA /RNA 脫靶事件降低到背景水平，實(shí)現(xiàn)了高精度、低脫靶的堿基編輯，將來(lái)還可以與識(shí)別不同PAM 的Cas 變體融合，進(jìn)一步擴(kuò)大靶向范圍，不僅為基礎(chǔ)研究帶來(lái)新的堿基編輯工具，更為重要的是有望極大提高將來(lái)臨床應(yīng)用的安全性。 "

深耕基因治療領(lǐng)域，邦耀生物突破不斷

邦耀生物作為一家全球最早進(jìn)行基因編輯技術(shù)研發(fā)和應(yīng)用的企業(yè)之一，自成立以來(lái)一直堅(jiān)持技術(shù)創(chuàng)新，不僅不斷克服行業(yè)壁壘進(jìn)行多管線戰(zhàn)略布局，同時(shí)致力于開發(fā)國(guó)際領(lǐng)先的基因編輯工具，獲得具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的核心技術(shù)。回首邦耀生物的開拓之路，無(wú)疑是一段不斷突破與創(chuàng)新的過(guò)程。目前，邦耀生物科學(xué)家團(tuán)隊(duì)在基因編輯工具開發(fā)、基因治療地中海貧血以及 CAR-T 技術(shù)創(chuàng)新領(lǐng)域，已經(jīng)取得很多重磅、突破性進(jìn)展：

2019年3月，Nature Medicine發(fā)文，發(fā)現(xiàn)利用基因編輯技術(shù)靶向編輯BCL11A紅系增強(qiáng)子，會(huì)重新開啟γ珠蛋白表達(dá)，代替有缺陷的β珠蛋白，有望達(dá)到根治β-地中海貧血目的;

2020年1月，Cell Research發(fā)文，率先證明單堿基編輯器編輯技術(shù)靶向HBG啟動(dòng)子激活胎兒期血紅蛋白的表達(dá)對(duì)于治療β-地中海貧血的可行性與有效性;

2020年3月，Nature Medicine發(fā)文，證明單堿基編輯技術(shù)可以靶向BCL11A的紅系增強(qiáng)子原件激活胎兒期血紅蛋白，或者編輯β血紅蛋白基因的特定突變，有望通過(guò)編輯自體造血干細(xì)胞治療包括β-地中海貧血在內(nèi)的遺傳性血液疾病;

2020年5月，Nature Cell Biology發(fā)文，報(bào)道自主研發(fā)的hyCBEs系列工具擁有更高的編輯活性和更寬的編輯窗口，對(duì)于β血紅蛋白病的治療具有更大的優(yōu)勢(shì);

2020年6月，Nature Biotechnology發(fā)文，開發(fā)一種全新的具有高特異性且安全的雙功能堿基編輯器A&C-BEmax;

2022年8月，Nature Medicine發(fā)文，公布了詳細(xì)的臨床數(shù)據(jù)，邦耀生物BRL-101基因治療地中海貧血癥患兒脫離輸血依賴已超過(guò)2年，并更為全面地解讀了BRL-101治療患者的療效和安全性特征;

2022年8月，Nature發(fā)文，證明了邦耀生物BRL-201非病毒PD1定點(diǎn)整合CAR-T療法出色的臨床安全性和有效性，使NHL患者無(wú)癌生存期最長(zhǎng)超過(guò)2年。

對(duì)此，邦耀生物創(chuàng)始人& 董事長(zhǎng)劉明耀教授表示， "本次高效精確的新型腺嘌呤堿基編輯器ABE9的開發(fā)，為單堿基編輯工具ABE在活性窗口和RNA脫靶風(fēng)險(xiǎn)兩方面的協(xié)同優(yōu)化提供了全新的思路。而邦耀生物自2020年以來(lái)，在堿基編輯器及其在基因治療遺傳疾病中的一系列突破性進(jìn)展，將會(huì)為基因治療再添利器。目前，邦耀生物已與國(guó)內(nèi)多家醫(yī)療單位合作，在基因編輯治療β-地中海貧血癥、非病毒PD1定點(diǎn)整合CAR-T、以及UCART等項(xiàng)目中已經(jīng)取得優(yōu)異臨床效果。未來(lái)，仍將通過(guò)不斷地加速推進(jìn)創(chuàng)新藥物的轉(zhuǎn)化與落地，從而造福包括地中海貧血在內(nèi)的全球罕見遺傳疾病及惡性腫瘤患者!"

關(guān)于邦耀生物：

上海邦耀生物科技有限公司致力于成為新商業(yè)文明時(shí)代全球領(lǐng)先的細(xì)胞基因藥企，邦耀生物以"以基因編輯引領(lǐng)創(chuàng)新，開發(fā)突破性療法，造福全人類"為使命，依托自主研發(fā)中心及與高校共建的"上海基因編輯與細(xì)胞治療研究中心"，過(guò)去5年已產(chǎn)生100多項(xiàng)專利成果，有5個(gè)項(xiàng)目在8所知名醫(yī)院開展研究者發(fā)起的臨床試驗(yàn)，多個(gè)項(xiàng)目進(jìn)入IND申報(bào)階段。其中，基因編輯治療β-地中海貧血癥、非病毒PD1定點(diǎn)整合CAR-T、以及UCART等項(xiàng)目已經(jīng)取得優(yōu)異臨床效果，具有全球領(lǐng)先性，并在Nature、Nature Medicine、Nature biotechnology等知名學(xué)術(shù)期刊上發(fā)表多篇學(xué)術(shù)論文。邦耀生物已搭建基因編輯技術(shù)創(chuàng)新平臺(tái)、造血干細(xì)胞平臺(tái)、非病毒定點(diǎn)整合CAR-T平臺(tái)、通用型細(xì)胞平臺(tái)、增強(qiáng)型T細(xì)胞平臺(tái)五大具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的技術(shù)平臺(tái)，擁有7000平米GMP中試基地及近200人的運(yùn)營(yíng)團(tuán)隊(duì)，有力保障創(chuàng)新的研究成果能夠快速轉(zhuǎn)化與應(yīng)用。邦耀生物通過(guò)患者需求和臨床反饋不斷推動(dòng)研發(fā)產(chǎn)品快速更新迭代。并秉持開放、共享、共贏的態(tài)度，與全球創(chuàng)新生物醫(yī)藥生態(tài)鏈企業(yè)一起，加快推進(jìn)創(chuàng)新藥物的轉(zhuǎn)化與落地，造福全球遺傳疾病及惡性腫瘤患者!

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